Ključni premisleki pri načrtovanju protokolov študije validacije očistka virusa izdelkov za gensko terapijo

ICH Q5A(R2)-Fundacija za mednarodno usklajevanje

ICH Q5A(R2) je bil uradno sprejet 1. novembra 2023 in predstavlja temeljni mednarodni dokument s smernicami za vrednotenje virusne varnosti. V primerjavi s Q5A(R1), objavljenim leta 1999, pomembne posodobitve v različici R2 vključujejo: novo dodano poglavje o vrednotenju virusne varnosti v neprekinjeni proizvodnji (7. poglavje); okrepljena vloga ocene tveganja kot temelja strategij očiščenja virusov; vključitev sekvenciranja naslednje{10}}generacije (NGS) v vidike odkrivanja virusov; in izrecne zahteve za vrednotenje novih izdelkov in proizvodnih procesov. Regulativni organi, vključno s FDA, EMA in PMDA, so sprejeli Q5A(R2), ki zagotavlja enoten tehnični okvir za validacijo očistka virusa po vsem svetu.

NMPA-kitajski regulativni sistem

Regulativni okvir NMPA za virusno varnost zajema več ravni:

Raven dokumenta	Ime dokumenta	Leto izdaje
Temeljni dokument	Tehnične smernice za odstranitev/inaktivacijo virusov iz krvnih pripravkov	2002
Temeljni dokument	Splošna načela tehničnega pregleda ovrednotenja virusne varnosti bioloških tkiv-proizvodov, pridobljenih iz-izdelkov, pridobljenih iz evkariontskih celic	2005
Smernice-za posamezne izdelke	Tehnične smernice za farmacevtske raziskave in vrednotenje aplikacij za klinična preskušanja za rekombinantne vektorje, povezane z adeno-virusom (rAAV),-ki temeljijo na izdelkih za gensko terapijo in vivo	2023
Smernice-za posamezne izdelke	Skupne tehnične zahteve za farmacevtsko kakovost rekombinantnega vektorja, povezanega z adeno-virusom (rAAV)-, ki temelji na izdelkih za gensko terapijo in vivo za pridobitev dovoljenj za promet	2025
Inovativna smernica	Tehnične smernice za validacijo platforme procesov odstranjevanja virusov za uporabo terapevtskih rekombinantnih beljakovinskih izdelkov v kliničnem preskušanju (poskus)a	2024

a: Ta smernica predstavlja prvič, da je kitajski regulativni organ določil sistematične tehnične zahteve za validacijo platforme procesov odstranjevanja virusov in je usklajena z duhom ICH Q5A(R2).

FDA in EMA-Regulativne zahteve ZDA in Evrope

FDA je januarja 2024 uradno izdala dokument s smernicami za industrijo, ki temelji na ICH Q5A(R2). Poleg tega poglavje Farmakopeje Združenih držav (USP)<1050.1>zagotavlja dodatne tehnične smernice za načrtovanje, vrednotenje in karakterizacijo postopkov očiščenja virusov. FDA vsaki dve leti organizira simpozij o odstranitvi virusov; simpozij 2023 je obravnaval vrhunske-teme, kot so nove modalitete, kontinuirana proizvodnja, novi kromatografski mediji in adsorpcijski filtri. Temeljni dokumenti s smernicami EMA vključujejo CPMP/BWP/268/95 (Opomba za smernice o študijah validacije virusov: Oblikovanje, prispevek in razlaga študij, ki validirajo inaktivacijo in odstranitev virusov) in EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Smernice o oceni varnosti virusov v biotehnoloških preiskavah Zdravila), ki sta bila usklajena z ICH Q5A(R2).

Identifikacija virov virusne kontaminacije

ICH Q5A(R2) poudarja, da mora zasnova validacije očistka virusa temeljiti na celoviti oceni tveganja. Pri izdelkih za gensko terapijo mora identifikacija virov virusne kontaminacije obravnavati naslednje ravni:

Raven celične banke: endogeni virusi (npr. retrovirusni delci) in latentno infektivni virusi, ki se lahko nahajajo v substratih proizvodnih celic (npr. HEK293, CHO, HeLa). Znano je, da celice HEK293 vsebujejo endogena zaporedja Ad5 E1 in približno 900 bp fragment EBV ter so sposobne izražati-replikacijsko kompetenten adenovirus; zato je treba temu tveganju pri oceni tveganja nameniti posebno pozornost.

Raven pomožnega virusa: proizvodnja vektorja AAV običajno uporablja metode, kot je trojna transfekcija z uporabo pomožnih plazmidov, ki nosijo tveganje za ustvarjanje replikacijsko-kompetentnega adenovirusa (RCA). Podobno lahko celice za pakiranje, ki se uporabljajo pri proizvodnji lentivirusnih vektorjev, ustvarijo replikacijsko-kompetenten lentivirus (RCL).

Raven surovin: Naključni virusi se lahko vnesejo prek surovin, ki se uporabljajo v proizvodnji, vključno z gojišči celične kulture, krmo in encimi. To tveganje je še posebej pomembno, kadar se uporabljajo sestavine-živalskega izvora (npr. fetalni goveji serum, prebavljene raztopine tripsina).

Razlike v tveganju: genska terapija v primerjavi s tradicionalnimi rekombinantnimi proteini

Dimenzija tveganja	Tradicionalni rekombinantni proteinski izdelki	Izdelki za gensko terapijo
Virusni vir	Endogeni virusi iz celične banke; naključni virusi	Virusi celičnih bank; virusi pomočniki; replikacijski-kompetentni vektorji (RCV/RCL); integracija gostiteljskega genoma
Celični substrat	CHO, NS0, Sp2/0 in druge dobro-okarakterizirane celične linije	HEK293, HeLa, CHO itd.; nekatere celične linije so tumorogenega izvora
Značilnosti izdelka	Zdravilo-na osnovi beljakovin; dobro-opredeljeno strukturo	Virusni vektor; predstavlja tveganje za biološko varnost
Strategija potrjevanja	Več{0}}stopenjsko očiščenje virusa; poudarek na validaciji korakov procesa	potrebno je zaznavanje RCV/RCL; validacija in testiranje sta bistvena
Validacija platforme	Uporabno za uveljavljene postopke, kot je S/D, nizek pH, nanofiltracija	Omejena uporabnost zaradi raznolikosti vrst vektorjev

Tabela 1. Primerjava varnostnih tveganj za viruse: izdelki za gensko terapijo v primerjavi s tradicionalnimi rekombinantnimi beljakovinskimi izdelki

Splošna načela

Izbira indikatorskega virusa je osrednji element pri oblikovanju protokolov za validacijo očistka virusa. ICH Q5A(R2) zahteva, da izbira indikatorskega virusa temelji na oceni tveganja in upošteva naslednje dejavnike:

Pomen virusa za produkcijski celični substrat (relevantni virus)

Fizikalno-kemijske lastnosti virusa (z ovojnico/brez -ovojnice, DNA/RNA, obseg velikosti)

Odpornost virusa na fizikalne/kemične obdelave

Zaznavnost in biološka varnost virusa

Pri izdelkih za gensko terapijo mora izbira indikatorskega virusa dodatno upoštevati: vlogo samega vektorskega virusa kot "relevantnega virusa"; možno tveganje okužbe s pomožnim virusom; ter zahteve za odkrivanje in preverjanje veljavnosti virusov,-kompetentnih za podvajanje (RCV/RCL).

Priporočena plošča indikatorjev virusov

Virus	Vrsta	ovojnica	Genom	Velikost (nm)	Utemeljitev izbora / prijava
MVM	Parvovirus	Noben	ssDNA	18–26	model brez{0}}ovojnice; najmanjša velikost in največja odpornost; primeren za validacijo nanofiltracije (na splošno ni uporabno za vektorske izdelke rAAV)
PPV	Parvovirus	Noben	ssDNA	18–26	model brez{0}}ovojnice; pogosto uporabljen indikatorski virus za krvne pripravke
Reo-3	Reovirus	Noben	dsRNA	60–80	model brez{0}}ovojnice; srednje velikosti; visoka fizična stabilnost
PRV	Herpesviridae	ja	dsDNA	150–200	Model z ovojnico; velika velikost; širok nabor gostiteljev
X-MuLV	Retrovirus	ja	ssRNA	80–110	Model retrovirusa z ovojnico; primeren za celične substrate, pridobljene iz CHO-
BVDV	Flaviviridae	ja	ssRNA	40–60	Model z ovojnico; uporablja se za oceno metod kemične inaktivacije (nadomestek HCV)
VSV	Rhabdoviridae	ja	ssRNA	70	Model z ovojnico; široka toleranca na pH; primeren za validacijo inaktivacije z nizkim-pH

Tabela 2. Priporočena plošča indikatorjev virusov za validacijo očistka virusa izdelkov za gensko terapijo

Posebna opozorila za izdelke AAV Vector

Za rekombinantne vektorske izdelke AAV tehnične smernice NMPA za farmacevtske raziskave in vrednotenje aplikacij za klinično preskušanje za-izdelke za gensko terapijo in vivo na osnovi rAAV vektorja zahtevajo pozornost odkrivanju replikacijsko-kompetentnega AAV (rcAAV). rcAAV se nanaša na AAV, ki je sposoben avtonomne replikacije, ki običajno nastane zaradi homologne rekombinacije med pomožnim plazmidom in produktom genoma AAV. Odkrivanje rcAAV se na splošno izvaja z uporabo infektivnih testov ali metod qPCR, ki se izvajajo ločeno na zdravilni učinkovini in prečiščenem izdelku.

Omeniti velja, da nadaljnji postopki čiščenja za vektorske produkte AAV običajno vključujejo nukleazno razgradnjo, kromatografijo (AEX), nanofiltracijo in ionsko izmenjevalno kromatografijo (CEX/IEX). Pri tradicionalni validaciji očistka virusa lahko ti koraki postopka povzročijo znatne izgube samega vektorja AAV; zato je treba med načrtovanjem pomanjšanega-modela skrbno upoštevati interakcijo med vektorskimi in indikatorskimi virusi. Za določene korake postopka (npr. nanofiltracija), kjer so izgube vektorja AAV znatne, je treba oceniti, ali so prilagoditve postopka upravičene na podlagi validacijskih podatkov (npr. prilagoditev velikosti por nanofiltracijske membrane).

Splošna načela

Zmanjšani-model (SDM) je osrednje orodje za validacijo očistka virusa; njegova zasnova mora natančno predstavljati učinkovitost očistka virusov v proizvodnem procesu. ICH Q5A(R2), razdelek 6.2.2, izrecno zahteva, da zmanjšani-model ohranja skladnost s proizvodnim procesom v ključnih parametrih. Pri izdelkih za gensko terapijo so pri načrtovanju SDM še posebej pomembni naslednji vidiki:

Reprezentativnost kritičnih procesnih parametrov

Zmanjšani-model mora biti skladen s proizvodnim procesom v naslednjih parametrih: kromatografski pogoji (sestava pufra, pH, prevodnost); nakladalno razmerje (masno razmerje vektor/supernatant protein); kontaktni čas in temperatura; pretok/zadrževalni čas; čistost in sestava izdelka. Za izdelke AAV je treba posebej obravnavati tudi učinek vektorske porazdelitve velikosti delcev in vsebnosti prazne kapside na učinkovitost nanofiltracije.

Zahteve glede kvalifikacij modela

ICH Q5A(R2) zahteva ustrezno kvalifikacijo zmanjšanega-modela, vključno s: primerjavo atributov kakovosti izdelka (npr. čistost, izkoristek, gostota); kvalifikacija konsistentnosti kritičnih procesnih parametrov; in zagotavljanje, da pomanjšani-model zajame variabilnost proizvodnega procesa. Za korake kromatografije je treba oceniti konsistenco profila vrhov, elucije in izpiranja; za korake nanofiltracije je treba preveriti učinke volumske zmogljivosti in sestave izdelka.

Formula za izračun LRV

Logitska vrednost zmanjšanja (LRV) je temeljna metrika za merjenje učinkovitosti virusnega očistka. ICH Q5A(R2), razdelek 6.5, nudi podroben opis metod izračuna LRV in statistične obdelave. Osnovna formula za izračun LRV je: LRV=log₁₀(N₀/N), kjer je N₀ začetni virusni titer po dodajanju virusa, N pa preostali virusni titer po procesni obdelavi. Ko titer preostalega virusa pade pod mejo detekcije testa, je treba uporabiti metode ocenjevanja, kot je Poissonova porazdelitev (npr. testiranje velike-volumne).

Uporaba intervalov zaupanja

Tako ICH Q5A(R2) kot EMA CPMP/BWP/268/95 zahtevata oceno intervala zaupanja rezultatov izračuna LRV. Običajno se uporablja 95-odstotni interval zaupanja.

Merila za učinkovitost

V skladu s tehničnimi smernicami NMPA za odstranjevanje/deaktivacijo virusov iz krvnih proizvodov zmanjšanje virusa, ki je večje ali enako 4 dnevnikom, pomeni, da je korak postopka učinkovit za odstranjevanje/deaktivacijo virusa. Vendar to merilo ni absolutni prag in ga je treba ovrednotiti na celovit način skupaj s krivuljami kinetike inaktivacije, znanstveno utemeljitvijo za izbiro indikatorskega virusa in splošno trdnostjo zasnove validacijskega protokola. Pri izdelkih za gensko terapijo je treba posebno pozornost nameniti kumulativni zmogljivosti očistka v vseh korakih postopka, da zagotovimo, da je splošni varnostni profil virusov na sprejemljivi ravni.

Uporaba in izzivi nanofiltracije

Filtracija-za zadrževanje virusov (nanofiltracija) je kritična stopnja odstranjevanja virusov pri nadaljnjem čiščenju izdelkov genske terapije. Tipični filtri za-zadrževanje virusov imajo velikost por približno 20 nm. Mehanizem očistka virusov pri nanofiltraciji temelji predvsem na izključitvi-na podlagi velikosti in lahko učinkovito odstrani večino virusov, večjih od velikosti por membrane, vključno z majhnimi parvovirusi brez-ovojnice, kot sta MVM in PPV.

Vendar se nanofiltracija za izdelke genske terapije sooča z edinstvenimi izzivi: velikost vektorjev AAV (približno 20–26 nm) je podobna velikosti določenih indikatorskih virusov (npr. MVM, 18–26 nm), kar lahko povzroči zmanjšano okrevanje vektorja; prazne kapside lahko vplivajo na filtracijski tok in učinkovitost zadrževanja virusa; viskoznost vzorca se lahko znatno poveča s koncentracijo vektorja. Zato bi morala zasnova SDM za validacijo nanofiltracije v celoti upoštevati učinke vektorske porazdelitve velikosti delcev in vsebnosti prazne kapside na učinkovitost filtracije, pri čemer je treba razmisliti o uporabi nanofiltracijskih membran z večjimi velikostmi por, kot je primerno.

Vrednotenje virusnega očistka kromatografskih korakov

Ionsko izmenjevalna kromatografija (IEX) je ključni korak v postopkih čiščenja produkta AAV, ki običajno uporablja razgradnjo nukleaze, ki ji sledi anionsko izmenjevalna kromatografija (AEX) za zajemanje praznih in okvarjenih kapsid, ali kationsko izmenjevalno kromatografijo (CEX) za fino čiščenje polnih kapsid. Mehanizmi očistka virusa v korakih kromatografije vključujejo izključitev velikosti, elektrostatične interakcije, afinitetne interakcije in druge dejavnike. Razprave na simpoziju FDA 2023 Viral Clearance Symposium so poudarile, da na učinkovitost kromatografskih korakov pri odstranjevanju virusov vpliva več dejavnikov, vključno z zmogljivostjo obremenitve, pH, prevodnostjo in kroženjem smole; za celovito vrednotenje je treba sprejeti večfaktorski ortogonalni načrtni pristop.

Nadzor virusne varnosti v kontinuirani proizvodnji

Na novo dodano poglavje 7 ICH Q5A(R2) določa posebne zahteve za vrednotenje virusne varnosti v neprekinjeni proizvodnji. Pri izdelkih za gensko terapijo je neprekinjena proizvodnja postala pomembna razvojna usmeritev, vendar uvaja tudi nove izzive glede virusne varnosti. Strategije nadzora virusne varnosti v neprekinjeni proizvodnji vključujejo:-linijske pregradne filtre proti virusom kot kritične zadrževalne ukrepe; ustrezno načrtovanje zadrževalnih časov in procesnih tokov; vključitev korakov inaktivacije z definiranimi časi zadrževanja; in izboljšana uporaba procesne analitične tehnologije (PAT) za-nadzor kritičnih procesnih parametrov v realnem času.